Atualizacão em diagnóstico de leishmaniose visceral canina

Atualmente estão disponíveis diversas metodologias para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). O diagnóstico laboratorial pode ser feito através do exame parasitológico direto, por meio de métodos imunológicos a imunofluorescência indireta (RIFI) ou ensaios imunoenzimáticos (ELISA), por método de imunohistoquímica e, mais recentemente, através de métodos moleculares de amplificação do ácido nucléico (PCR e PCR-Real Time). Cada metodologia tem particularidades que devem ser conhecidas pelo clínico no momento da requisição e da interpretação do exame.

Exame Parasitológico Direto

O exame direto é baseado na pesquisa da Leishmania sp. em aspirado de lesões cutâneas,  medula óssea, linfonodo, baço ou raspado das bordas das lesões. Neste exame é feita a pesquisa direta das formas amastigotas do parasita. Trata-se de um teste de alta especificidade, ou seja, uma vez visualizado o parasita não há dúvidas quanto à positividade da amostra. Todavia, o Exame Parasitológico Direto está sujeito a resultados falso-negativos, especialmente nos casos em que a parasitemia é muito baixa e/ou quando a coleta e o material coletado são inadequados. Conforme literatura, os esfregaços têm positividade de 50% a no máximo 80%, sendo um exame essencial no diagnóstico da leishmaniose tegumentar.

Sorologia

A sorologia (Imunofluorescência e ELISA) é extensamente utilizada no diagnóstico da LVC e em inquéritos epidemiológicos. Seus resultados baseiam-se na detecção de anticorpos anti-leishmania, não avaliando a carga parasitária, mas a resposta imunológica do animal contra o agente. Podem, portanto, acontecer resultados falso-negativos e falso-positivos.

A melhor forma de aumentar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico é a realização combinada de dois testes, ELISA e RIFI, em vez de realizar apenas RIFI, teste considerado o “padrão-ouro” pelo Ministério da Saúde (MS). A utilização de ambos os testes diminui o número de leituras de falso-negativos e de falso-positivos, aumentando a assertividade do diagnóstico e evitando a eutanásia de cães sadios.

Em animais com resultados discordantes entre as metodologias, o mais indicado é considerar o quadro clínico do animal e repetir o exame após um mês. Pode-se, ainda, realizar o Exame Parasitológico Direto e/ou PCR. É importante ressaltar que resultados negativos nestas metodologias não devem ser usados como confirmatórios, pois esses testes detectam o agente, que pode estar ausente na amostra coletada (configurando o resultado falso-negativo).

Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

Vários estudos demonstram que a PCR é altamente específica e mais sensível do que os métodos microbiológicos clássicos utilizados para o diagnóstico da LVC. A utilização da PCR permite a detecção do parasita com uso de sondas específicas de forma não invasiva, através da amplificação do cinetoplasto da Leishmania sp.

A PCR pode ser utilizada em qualquer amostra biológica, incluindo pele, sangue, biópsia de linfonodo e medula óssea.

Reações falso-negativas podem ocorrer quando a quantidade de DNA está abaixo da sensibilidade de detecção do teste.

PCR- Real Time

A técnica PCR Real Time é uma categoria de PCR que permite a detecção e quantificação em tempo real de uma região específica do material genético. Para que isso ocorra, são empregadas sondas específicas para o fragmento alvo, marcadas com fluoróforos. Durante a amplificação do DNA, essas sondas se ligam ao fragmento alvo e são inativadas enzimaticamente. Ao serem inativadas, ocorre emissão de fluorescência, que é proporcional a um determinado produto da PCR. A detecção de fluorescência indica a presença ou ausência das regiões pesquisadas, de forma rápida, precisa e sensível.

Imunohistoquímica (IHQ)

O exame imunohistoquímico (IHQ), permite a identificação de Leishmanias na pele dos cães, independentemente da sua condição clínica, permitindo avaliar seu potencial como reservatório, antes e durante o tratamento. Este exame tem sido uma ferramenta vital para a corroboração dos tratamentos efetuados. A literatura internacional e nacional demonstra que os cães têm suprimida ou reduzida sua condição infecciosa, com diferentes protocolos de tratamento. Cães em tratamento por até 18 meses, demonstraram que, antes de seu início, em 14% foram encontradas formas amastigotas na pele e na sua seqüência, em 0,9% da amostra.

Dúvidas mais freqüentes

Que exame pedir para o diagnóstico no caso de suspeita clínica?

Os testes de triagem recomendados são a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o ELISA. Ambos são feitos a partir do soro do animal. Em caso de suspeita de leishmaniose tegumentar, realizar o Exame Parasitológico.

Como proceder em caso de sorologia negativa em animal com forte suspeita clínica?

A recomendação é repetir a sorologia dentro de 1 a 3 meses. Pode-se ainda optar pelo Exame Parasitológico Direto em punção de linfonodo ou medula óssea. Lembrar sempre que, nos exames que detectam o agente, resultados negativos não são confirmatórios.

E em caso de sorologia positiva em animal sem suspeita clínica?

A recomendação é o acompanhamento clínico do animal e a realização de um exame mais específico, como a PCR ou Exame Parasitológico Direto.

Como avaliar resultados discordantes nos testes sorológicos?

Recomenda-se repetir o exame sorológico dentro de 1 a 3 meses e/ou  realizar exames mais específicos, como a PCR ou Exame Parasitológico Direto.

Como avaliar resultados indeterminados nos testes sorológicos?

O resultado indeterminado pode significar:

– Um resultado falso positivo, devido a razões biológicas (anticorpos inespecíficos/ reações cruzadas);

– Um resultado verdadeiro positivo, fruto de uma infecção adquirida recentemente (“janela imunológica”). Denomina-se “janela imunológica” o intervalo entre a infecção e a detecção de anticorpos por técnicas laboratoriais. Logo, resultados indeterminados devem se interpretados com cautela. Recomenda-se repetir o exame sorológico dentro de 1 a 3 meses e/ou realizar exames mais específicos, como a PCR ou Exame Parasitológico Direto.

Como estabelecer condição sorológica antes da vacinação?

A recomendação é a realização de exames sorológicos, ELISA e RIFI. Deve-se lembrar que o animal pode estar na “janela imunológica”.

Quais as vantagens da Técnica PCR Real Time na detecção das Leishmanioses?

– Monitoramento da carga parasitária: quantificação da expressão gênica em diferentes amostras biológicas.

– Detecção rápida da Leishmania: graças à amplificação e à detecção simultâneas dos produtos a cada ciclo realizado, a PCR Real Time representa uma significativa redução de tempo na realização nos testes moleculares.

– Especificidade: no PCR Real Time para Leishmania, é utilizado material genético específico desse parasita, garantindo que apenas material genético de Leishmania seja alvo da reação.

– Sensibilidade: a seleção da sequência alvo determina a sensibilidade e a especificidade do teste. Uma maior sensibilidade é atingida quando sequências de DNA presentes em cópias múltiplas são utilizadas, como, por exemplo, a região conservada dos minicírculos de DNA do Cinetoplasto (kDNA). O kDNA apresenta cerca de 10.000 minicírculos de DNA distribuídos em uma região conservada e uma região variável. Iniciadores específicos para amplificar esta região conservada são úteis na detecção de todas as espécies de Leishmania, enquanto aqueles direcionados para a região variável permitem a diferenciação de cada espécie ou complexo de espécies existentes. Tais particularidades fornecem maior eficiência à reação e, consequentemente, ao diagnóstico e monitoramento durante a terapêutica da leishmaniose.

Quando solicitar testes moleculares por PCR Real Time na detecção das leishmanioses?

A abordagem quantitativa pode ser útil no monitoramento da carga parasitária em tecidos caninos em fase de tratamento e pós-tratamento. Assim, é possível identificar recidivas da leishmaniose, acompanhar a evolução da patologia e avaliar a eficiência de um tratamento farmacológico. Conseqüentemente, o teste fornece informações para a otimização do tratamento e quanto ao prognóstico da infecção.

O Santé Laboratório realiza todos os testes para um diagnóstico completo juntamente com a avaliação do Clínico Veterinário.

Observações:

– Todas as amostras devem ser coletadas em frasco estéril.

– Enviar as amostras refrigeradas em até 24 horas.

A confiabilidade, especificidade e sensibilidade do teste dependem do cumprimento de todas estas recomendações.

“Acreditamos que a união entre os agentes envolvidos com a LVC, quais sejam, os médicos veterinários clínicos, os de saúde pública e a comunidade de proprietários de cães devem estar imbuídos de um espírito de mútua colaboração e responsabilidade. Muitas pesquisas estão por vir, sedimentando os conceitos até aqui produzidos ou modificando condutas. A ciência é feita sem radicalismos ou afirmações movidas por emoções, mas deve fundamentar-se sobretudo no respeito a vida.”     Ribeiro, V.M.

* Gláucia Mansur Balsamão, M.V., Me Medicina Veterinária Preventiva, MBA GesNeg, Membro Red FAO Salud Publica Veterinaria y Zoonosis para America Latina y el Caribe.